无血清细胞冻存液试剂：Cell Reservoir One,Vitrify

 玻璃化冷冻法可以有效保证细胞在解冻后具有较高的存活率，因而已成为标准慢程序冷冻方法的重要替代方法。然而，玻璃化需要超快速的冷冻程序，从制造细胞悬浮液到冷冻在液氮中通常不超过15秒。

Cell Reservoir One,Vitrify是一种新型的用于玻璃化的无血清细胞培养冷冻培养基，其主要成分为从蚕茧中分离得到的水溶性糖蛋白丝胶蛋白。即使采用更长时间的冷冻方案，Cell Reservoir One,Vitrify也能使灵长类细胞(如猴胚胎干细胞和人类IPS细胞)具有很高的存活率;从细胞收集到在液氮中冷冻长达60秒。

  无血清细胞冻存液试剂 产品特点：

1. 经过较长时间的操作（长达60秒），仍可以保持细胞高存活率。

2. 对细胞低毒性，不含有DMSO和乙酰胺

3. 可以用于灵长类胚胎干细胞和人IPS细胞

 应用实例1：人诱导多功能干细胞的存活率比较（201B7 细胞系*）

*Takahashi, K. et al. Cell, 2007 Nov 30;131(5):861-872

冷冻流程：60秒

人IPS细胞在Cell Reservoir One,Vitrify和DAP213中冷冻保存2周以上。

细胞解冻后4天用碱性磷酸酶检测细胞存活率。Cell Reservoir One,Vitrify细胞存活率高，而DAP213大部分细胞死亡。

冷冻流程：15秒

人IPS细胞在Cell Reservoir One,Vitrify、DAP213和A公司产品中冷冻保存2周以上。

细胞解冻后4天用碱性磷酸酶检测存活率。Cell Reservoir One,Vitrify保存的细胞表现出的生存能力。

结论：Cell Reservoir One (Vitrify) 在经过 15 或 60 秒冷冻时间后都显示较高的细胞存活率。在 60 秒冷冻操作的情况下，Cell Reservoir One (Vitrify) 的细胞存活率显著高于其它试剂产品。

应用实例2：灵长类干细胞恢复率的比较。

应用实例3：人iPS细胞(253G1)与竞争对手复苏率的比较

人iPS细胞用不同公司的冷冻培养基中冷冻15秒，冷冻保存2小时。

解冻后4天评价复苏率。Cell Reservoir One (Vitrify) 全部回收率

应用实例4：人iPS细胞（253G1）复苏率的比较及未分化状态的检测

与DAP213相比，Cell Reservoir One (Vitrify) 具有更高的复苏率。冻结操作的时间（15秒

或60秒）不影响细胞的复苏率，以及未分化标记基因的表达也可以证明。

操作步骤：

细胞冻存 

1. 在干净的工作台附近准备镊子和液氮。
2. 分离灵长类动物的ES/iPS细胞（0.25%胰蛋白酶/胶原酶IV溶液），并小心收集细胞。
3. 将细胞收集到离心管中，离心并尽可能多地去除上清。Cell Reservoir One (Vitrify)的浓度被上清液稀释可能降低细胞活性。
4. 加入200ul的Cell Reservoir One (Vitrify)，小心用移液器混合4-5次，以分散细胞。将细胞迅速转移到冻存管中。
5. 将冻存管2/3浸入到液氮中10秒，然后*浸没。为了增加成功率，4-5步骤需要在60秒内完成。
6. 将冻存管转移到液氮培养罐保存。

细胞复苏

1. 在离心管中，37℃水浴预热10ml细胞培养基。
2. 从液氮罐中取出装有冷冻细胞的低温保存管，转移到干净的工作台上，并保证其浸泡在液氮中。
3. 从液氮中取出管子。打开盖子，把管里的液氮倒置丢弃
4. 在冻存管中加入超过800ul的预热细胞培养基，并用移液枪吹打几次，使细胞迅速解冻。根据冻存管大小加入的培养基越多细胞解冻越快。
5. 将细胞悬浮液转移到步骤1的离心管中。3-5步骤操作越快越好
6. 用细胞培养基清洗冻存管，将培养基转移到步骤1的离心管中。
7. 离心收集细胞，转移到新鲜培养基中培养。尽可能多的去除上清。

注意：

1) 使用前先对目标细胞进行预试验。

2) NACALAI不承担因使用本产品而产生的任何损害或损失的责任。

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